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Caspases酶系列1:底物及抑制剂

发布者:买球网科技    发布时间:2021-01-20     
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       最近很多小伙伴向买球网咨询各种Caspase的底物当日"就来跟大家好好聊聊Caspase家族及各类Caspase酶对应的底物Caspases(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶)是1类蛋白酶家族其功能与凋亡(程序性细胞死亡)坏死和发烧(炎症)的过程密切相关.

 

Caspase.png

 

       什么是胱天蛋白酶?

      胱天蛋白酶(Caspases)是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶它们是为细胞凋亡的主要介质.多种受体例如TNF-α 受体FasL受体TLR和死亡受体以及Bcl-2和凋亡抑制剂(IAP)蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径.1旦Caspase受到上游信号(外部或内于)刺激被激活即会参与执行下游蛋白底物的水解作用并触发1系列事件导致细胞分解死亡吞噬作用和细胞碎片的清除.

 

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为3大类:第1类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力.第2类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成而第3类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成(表1).

 

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类:

 

细胞死亡途径 半胱天冬酶类型 酵素 物种
细胞凋亡 启动器 Caspases 2 人与鼠
细胞凋亡 启动器 Caspases 8 人与鼠
细胞凋亡 启动器 Caspases 9 人与鼠
细胞凋亡 启动器 Caspases 10 人的
细胞凋亡 效应器 Caspases 3 人与鼠
细胞凋亡 效应器 Caspases 6 人与鼠
细胞凋亡 效应器 Caspases 6 人与鼠
细胞焦亡 炎性的 Caspases 1 人与鼠
细胞焦亡 炎性的 Caspases 4 人的
细胞焦亡 炎性的 Caspases 5 人的

 

       启动器Caspase和效应器Caspase

      根据其于凋亡胱天蛋白酶途径中的作用胱天蛋白酶可分为两类:启动器和效应器Caspase酶.启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点Caspase酶的识别位

 

Caspase-enzyme.jpg

 

      凋亡启动器Caspase酶例如caspase-2-8-9和-10可以启动caspase激活级联反应.Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物(DISC)是必不可少的并且于激活后Caspase-8激活下游效应子Caspase(例如Caspase 3)并介导线粒体中细胞色素c的释放.Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性.凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3-6和-7虽然不负责启动级联途径但是当被激活时它们于级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用.Caspase-3(CPP32 / apopain)是关键效应器因为它放大了来自启动器Caspase的信号使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测可以检测Caspase-3的活性.

 

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成:Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序.不同Caspase识别序列不同1般由3个或4个氨基酸组成(表2).Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基(Ac)碳苯甲氧基(Z)基团修饰以增强膜的通透性.对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点释放产生信号或抑制信号的基序.Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比.

 

       表2. Caspase底物及其序列

 

多肽 氨基酸序列 对应的Caspase的种类
IETD Ile-Glu-Thr-Asp Caspase 8颗粒酶B
DEVD Asp-Glu-Val-Asp Caspase 3 .6 .7 .8或10
LEHD Leu-Glu-His-Asp Caspase 9
VAD Val-Ala-Asp Caspase 1 .2 .3 .6 .8 .9或10

   

       Caspase的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成常见的生色团有pNA(对硝基苯胺或4-硝基苯胺)可使用酶标仪或分光光度计于405 nm处进行光密度检测.

 

       表3. Caspase的显色底物

 

底物 Caspase 吸收(nm) 颜色 规格 货号
Ac-DEVD-pNA * CAS 189950-66-1 * 半胱天冬酶3 405 nm 黄色 5 mg 13405
Z-DEVD-pNA 半胱天冬酶3 405 nm 黄色 5 mg 13422
Z-IETD-pNA * CAS 219138-21-3 * 半胱天冬酶8颗粒酶B 405 nm 黄色 5 mg 13413

 

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团例如7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)7-氨基-4-3氟甲基香豆素(AFC) Rhodamine 110(R110)或ProRed™620.R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物(例如AMC和AFC)更敏感但由于两步裂解过程其动态范围更窄. 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定.

 

Caspase-substrate.jpg

 

      图.从左到右分别是AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)AFC(7-氨基-4-3氟甲基香豆素)Rhodamine 110(R110)和ProRed™620的激发和发射光谱.

 

       表4.荧光半胱天冬酶底物.

 

底物名称 对应的Caspase Ex(nm) Em(nm) ε¹ Φ² 规格 货号
Ac-DEVD-AFC * CAS 201608-14-2 * 半胱天冬酶3 .7 376 482 17000 0.53 5mg 13401
Ac-DEVD-AMC * CAS 169332-61-0 * 半胱天冬酶3 .7 341 441 19000 N / D 5mg 13402
Z-DEVD-AFC 半胱天冬酶3 .7 376 482 17000 0.53 5mg 13420
Z-DEVD-AMC * CAS 1135416-11-3 * 半胱天冬酶3 .7 341 441 19000 N / D 5mg 13421
Z-DEVD-ProRed™620 半胱天冬酶3 .7 532 619 N / D N / D 1mg 13433
(Z-DEVD)2 -R110 * CAS 223538-61-2 * 半胱天冬酶3 .7 500 522 80000 N / D 1mg 13430
Z-DEVD-ProRed™620 半胱天冬酶3 .7 532 619 N / D N / D 1mg 13433
Ac-IETD-AFC * CAS 211990-57-7 * 半胱天冬酶8颗粒酶B 376 482 17000 0.53 5mg 13410
交流电-IETD-AMC 半胱天冬酶8颗粒酶B 341 441 19000 N / D 5mg 13411
Z-IETD-AFC * CAS 219138-02-0 * 半胱天冬酶8颗粒酶B 376 482 17000 0.53 5mg 13425

 

       注意:

 

        1.ε=于其好的吸收波长处的摩尔消光系数(单位= cm -1M -1).

      2.Φ=水性缓冲液(pH 7.2)中的荧光量子产率.

 

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接通常Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列诸如醛(-CHO)或氟甲基酮(-FMK)的官能团组成.具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的而具有FMK的抑制剂是不可逆的.半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用因此它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具.

 

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

 

抑制剂 Caspase的种类 是否可逆 Ex(nm) Em(nm) 规格 货号
Ac-DEVD-CHO * CAS 169332-60-9 * 半胱天冬酶3 .7 可逆的 -- -- 1mg 13403
Ac-IETD-CHO * CAS 191338-86-0 * 半胱天冬酶8 可逆的 -- -- 5mg 13412
mFluor™450-VAD-FMK 半胱天冬酶12368910 不可逆的 406 445 25 tests 13475
mFluor™510-VAD-FMK 半胱天冬酶12368910 不可逆的 412 505 25 tests 13476
FITC-C6-DEVD-FMK 半胱天冬酶3 .7 不可逆的 491 516 1mg 13406
FITC-C6-DEVD-FMK 半胱天冬酶3 .7 不可逆的 491 516 100ug 13408
FITC-C6-LEHD-FMK 半胱天冬酶9 不可逆的 491 516 1mg 13407
FITC-C6-LEHD-FMK 半胱天冬酶9 不可逆的 491 516 100ug 13409
FAM-VAD-FMK 半胱天冬酶12368910 不可逆的 493 517 25 tests 13470
SRB-VAD-FMK [磺胺"稡-VAD-FMK] 半胱天冬酶12368910 不可逆的 559 577 25 tests 13472

 

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