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重组蛋白质的表达 .纯化 .复性和定量

发布者:买球网科技    发布时间:2021-06-08     
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按操作手册进行具体步骤如下.


1 .重组蛋白质的诱导表达


1.挑取转化有质粒的单菌落接种于 3ml 选择性 LB 液体培养基中37 oC250rpm/min 振摇培养过夜.


2. 次日将培养过夜的菌液 500 μl 再接种于 10 ml(1:::20)选择性 LB 液体培养基中37 oC250 rpm/min 振摇培养至光密度(OD600=0.6)时取 1 ml 样本作为诱导前标本10000g 离心 1 min 收集菌体沉淀-20 oC 冻存备用.


3. 加入 1 mol/L IPTG 于菌液中使 IPTG 终浓度为 1 mM37 oC250 rpm/min振摇培养 4~5 小时.取 1 ml 样本作为诱导后标本同上法收集菌体沉淀-20 oC 冻存备用.


4. 将诱导前后菌体沉淀用 20 ~ 40 μl PBS(pH= 8.0)重悬加入等体积的 2×SDS上样缓冲液煮沸加热 5 minSDS 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离 考马斯亮蓝染色 3 小时后脱色观察结果.


5. 选取诱导成功的细菌克.扩大诱导规模收集菌体沉淀于-20 oC 保 存 准备做下1步分析及纯化.


2 .重组蛋白质的分离纯化


重组蛋白质的可溶性鉴定

1.将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中然后于-80 oC 低温冰箱中放置 10 min.


2. 冰中解冻.


3. 于冰浴上用超声破碎仪破菌 6 次每次 10 sec间歇 10 sec电压 200-300 V.


4. 10000g4oC离心 20 min取上清(为溶液 A) -20 oC 保存;另将沉淀用同样裂解液 1 溶解(为溶液 B)同样-20 oC 保存供后继分析使用.


5. 将上述 A .B 溶液和诱导前后的细菌进行 SDS-PAGE 电泳考马斯亮蓝染色比较分析重组蛋白质的溶解性.如果诱导表达的蛋白质位于 A 溶液中则为可溶性蛋白;如果是于 B 溶液中则为非可溶蛋白.


重组蛋白质为非可溶性蛋白(变性条件下)的分离纯化

1.将菌体沉淀溶于适量裂解液 2(Lysis buffer under denaturing conditions )中室温下搅拌和吹打沉淀避免泡沫生成.


2. 10000g4 oC离心 30 min收集上清液.


3. 将 Ni-NTA Agarose 充填柱子并连接于 Pharmarcia 低压液相层析系统用 5倍柱体积的裂解液 2 平衡 Ni-NTA Agarose调节 A280 值至零线.


4.将适量上清液上样到 Ni-NTA Agarose 柱子中并用 lysis buffer 冲洗至 A280值低于 0.01.


5. 分别用 5~10 倍柱体积的清洗液 1 和清洗液 2(Wash buffer 1 and 2)清洗柱子直至 A280 值低于 0.01.


6. 用洗脱液(Elution buffer)洗脱重组蛋白质于 A280 值监测下收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液.


3 .重组蛋白质的复性 .冻干和定量

纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析最终用 0.01×PBS 透析透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状.以牛血清白蛋白(BSA)为标准采用 BIO-RAD 公司蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量.




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