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肿瘤细胞体外传代培养及保种

发布者:买球网科技    发布时间:2021-05-19     
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1细胞复苏与培养

将液氮或-80oC 保存的肿瘤细胞于 37oC 水浴, 快速溶化, 用 8.0ml 培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液, 于 1500 转/分, 离心 3 分钟.弃上清, 再吸取 8.0ml 培养基质混匀细胞沉淀, 再 1500 转/分, 离心 3 分钟, 弃上清, 细胞沉淀用 1.0ml 培养基混匀, 备用. 另取1个 75cm2 方瓶, 加入 14.0ml 培养基质, 将上述制备的含肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中, 于 37oC5%CO2 孵育箱中培养.


若此肿瘤细胞悬浮生长, 大约 3-4 天细胞基质会变黄, 5.0ml 细胞悬液可传代1个方瓶培养, 可用 3-4 个方瓶培养, 1个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达 1—1.5×107 个, 根据试验所需, 可决定传代的次数. 若此肿瘤细胞呈贴壁生长, 经过 3—4 天, 肿瘤细胞生长至 80%—95% 单层时, 弃上清, 用 0.5mM 的EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml), 处理肿瘤细胞大约 3—5 分钟, 用倒置显微镜观察当 90% 的肿瘤细胞变圆时, 即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到 15ml 离心管中, 于 1500 转/分下离心 3 分钟, 弃上清, 加少许培养基混匀, 可传代 3 个 75cm2方瓶扩大培养.

2细胞冻存


将对数生长的肿瘤细胞用 1 个 75cm2方瓶按上述方法收集, 于 1500 转/分离心 3 分钟,弃上清, 用保种液(含 10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混匀, 分别加入到 2—3 只保种管中, 写上肿瘤细胞名称, 时间, 保种者姓名, 放-80o C 保存, 次日将它们转移到液氮中保存(注: -80o C 下可保存细胞半.至1., 液氮可保存细胞 5—10 ., 甚至更长的时间).以上所有物品均需经过高温灭菌( 121oC, 30 分
钟)培养基质则经过过滤(0.22uM)除菌, 所有操作均必须遵守无菌操作技术, 避免细菌 .真菌 .病原体 .衣原体等污染.


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