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组蛋白提取

发布者:买球网科技    发布时间:2021-06-08     
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组蛋白有4种类型:H2A .H2B .H3 .H4组蛋白是染色体基本结构蛋白因富含碱性氨基酸 Arg 和 Lys 而呈碱性可与酸性的 DNA 紧密结合.因为组蛋白是偏碱性的因此买球网可以使用酸法来提取.


实验操作步骤:


1 .将 3-5×105 个细胞种到 6 孔板中接着进行自己需要的实验处理处理结束后开始收蛋白先用 1×PBS 将细胞洗两次每次吸尽上清.


2 .每孔加入 200ul NETN 裂解液冰上裂解 15min


High salt NETN buffer


母液

配制 100ML


20mM Tris,PH=8.0

1M

2ml


500mM NACL

5M

10ml


0.5% NP-40

20%

2.5ml


1mM EDTA

0.5M

200ul


H2O


85.3ML


临用前加蛋白酶抑制剂





3 .用细胞刮刮细胞将细胞收集于 1.5mlEP 管中1500g,4℃离心 10min


4 .离心结束后可以于管底看到1小团接近透明的沉淀小心吸尽上清用 1ML NETN buffer 洗沉淀1次或两次1500g,4℃离心 10min


5 .吸尽上清小心吸沉淀容易被吸走加入 0.2M HCL 100ul (浓盐酸的浓度为 12M)冰水裂解 30min,(30min 后沉淀变成1个白色的小团块)


6 .12000RPM4℃15min 离心此时组蛋白已经溶解于上清中将上清转移到新的 EP 管中加入 20ul 的 1M Tris ph=8.0 中和酸性(5 倍体积的 HCL 加 1 倍体积的 1M Tris PH=8.0, 如 100ul 的上清中可加入 20ul 的 1M Tris.


若中和不充分则于下1步加入 SDS 的时候溶液会呈现黄色可适量补加 1M Tris PH=8.0只到溶液恢复蓝色).


7 .可用考马斯法测蛋白浓度


8 .用 SDS 煮蛋白100℃10min..接下来可进行 Western blot 实验.


9 .跑胶时上样量为 5ug 时比较适宜.可以根据自己的具体实验进行调整.


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