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  • ProSpec 细胞因子和重组蛋白溶解

    买球网知道ProSpec 相当1部分细胞因子和蛋白为冻干粉这使得运输非常便捷只要常温即可.而且细胞因子和蛋白 冻干粉非常稳定于-20-80条件下可保存数..冻干粉于使用前需进行溶解然后以液体形式加到培养体系.溶解步骤非 常关键因溶解不好会导致细胞因子或蛋白的失活这也是很多用户于实际使用中经常遇到的问题.

    那么应该如何进行正确的溶解呢? 

    下面买球网以 Recombinant Human IL-4 (重组人 IL-4产品编号:CYT-211)的说明书为例对细胞因子或蛋白的溶解方法 进行详细的阐述. 

    拿到重组人 IL-4 的说明书后您会发现有1段关于 Reconstitution(重悬)的叙述这段内容含有溶解相关的所有信息.


    1. Centrifuge the vial prior to opening  

    1 步:开盖前离心试剂管 

    ProSpec 的细胞因子或蛋白冻干粉装盛于塑料管中为无菌包装.冻干粉于运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁 或管盖上所以于打开塑料瓶盖前需将冻干粉通过离心收集到管底以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解. 

    有很多用户会问1个问题即应该用多少转速 .多长时间离心试剂管才能达到良好的收集效果? 

    答:有些小型高速离心机(多为进口品牌)的面板上有1个 Spin 键按了此键后离心机会自动快速上升到其好的速度 (10000rpm 12000rpm)上升到好的点后速度即刻下降直至停止旋转整个过程大约 30s.这个 Spin 键足以很好的将细 胞因子或蛋白收集到管底.但有些实验室没有这样的高速离心机只有好的转速为 4000-4500rpm 的离心机.这种情况下需 3000-3500rpm 离心 5min也能达到类似的效果.


    2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do notvortex. 

    2 步:用无菌水重悬至 0.1-1.0 mg/ml不可振荡. 

    这个步骤即为溶解步骤非常重要. 

    1) 1定要用推荐的溶液重悬(或溶解)冻干粉 

    用于溶解细胞因子或蛋白的溶液千差万别.此例中的重组人 IL-4 需用水溶解而重组人 IL-2 (产品编号:CYT-209)则需用 20mM Acetic Acid (醋酸)溶解重组人 TGF-beta1(产品编号:CYT-716)需用 10mMAcetic Acid (醋酸)溶解 (注:即使同1 重组细胞因子或蛋白不同批次的溶解方法也可能有所不同因此上面的叙述仅供参考.具体应该如何溶解应以相应批次的官方 说明书为准).后续的文章中将对各种溶解液的配制方法进行详细的阐述望继续关注. 

    经常有用户会问为什么会有这么多种溶解方法? 

    答:买球网知道蛋白的溶解性与很多因素有关其中比较重要的是 pH 值和离子强度.ProSpec 的细胞因子或重组蛋白于 出厂前均经严格测试说明上所标明的溶解液是能够将该细胞因子或重组蛋白完全溶解的液体.如果您所用的溶解液的 pH 值和 离子强度与说明书中所标明的不符很多时候会造成细胞因子或重组蛋白不能完全溶解或者根本无法溶解这样所配得的细胞因 子或重组蛋白必然活性不够或丧失. 

    有不少用户没注意说明书上的描述而是根据习惯直接用 PBS 或培养液(1640 或 DMEM 等)等溶解细胞因子或蛋白的 冻干粉.这样做可.穑

    答:有时可以要看具体情况.ProSpec 的大多数细胞因子或蛋白冻干粉的溶解液不是 PBS此时千万不能用 PBS 或培 养液直接来溶解具体原因于上面已经叙述过.而有部分细胞因子如重组人 KGF 和重组人 FGF-23 等说明书上的溶解液即为 1x PBS此时用 PBS 溶解完全没问题那么用培养液溶解也是可以的不过好的还是用先用 PBS 溶解然后再用培养液稀释. 

    2) 1定要溶解到指定的浓度. 蛋白于1定的浓度范围内可以保持良好的稳定性这个范围就是说明书上所标明的浓度范围该例为 0.1-1.0mg/ml. 这个浓度范围对于不同的细胞因子或重组蛋白是不同的. 

    高于或低于该浓度范围会有什么问题呢? 

    答:首先细胞因子或蛋白会不稳定即很容易出现活性下降的现象.其次高于这个浓度范围可能会超过该蛋白的 好的溶解浓度即蛋白无法完全溶解.再者高于或低于该浓度范围蛋白可能会出现聚集(aggregation)最终结果还是部分 蛋白未溶解导致蛋白活性的减弱. 

    3) 1定不能振荡(vortex)

    这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡. 

    有用户会问若想保证溶解液与冻干粉充分混匀以实现细胞因子或重组蛋白的完全溶解该怎么办呢?

    答:多数细胞因子或重组蛋白的冻干粉是非常容易溶解的1般买球网用移液枪的枪头轻吹几下即可使细胞因子或重组 蛋白完全溶解. 

    对于不易溶解的细胞因子或蛋白ProSpec 会于说明书中进行备注.这种情况下您好的能将要溶解的细胞因子或重组 蛋白放于水平摇床(shaker)上低速摇1段时间促使细胞因子或重组蛋白完全溶解. 


    3. This solution can be stored at 2-8for up to 1week. 

    3 步:该重悬液于 2-8最长可保存 1 周. 

    用说明书上推荐的溶液将细胞因子或重组蛋白重悬到推荐的浓度后细胞因子或重组蛋白可放置于 2-8即冰箱的冷藏室. 于这种条件下细胞因子或重组蛋白的活性最长可保持 1 周.这对1个周期为 5-7 天的实验如 DC(树突状细胞)的诱导成熟是 足够的.于此期间只要每次从冰箱里吸取1定量的细胞因子或重组蛋白溶液加入到培养体系内即可. 

    其实说明书上推荐的浓度对于1般的实验来讲是比较高的.所以用户通常会将该溶液进1步稀释后再放于 4保存待 1 周内用完.如进行稀释必须遵照下面第 4 步的方法即需用含载体蛋白的溶液进行稀释否则稀释后的细胞因子或重组蛋白很 容易会粘附于管壁或瓶壁上使得溶液中的细胞因子或重组蛋白的浓度下降细胞因子或重组蛋白的总活性则大为减弱.


    4. For extended storage, it is recommended to further dilute in abuffer containing a carrier protein (example 0.1%  BSA) and store in workingaliquots at -20to -80

    4 步:如要长期保存则需用含载体蛋白(0.1% BSA10% FBS5% HSA)的溶液进1步稀释然后分装冻存于-20-80

    如果1个实验周期长于1周或配制的细胞因子或重组蛋白1次用不完买球网就需对细胞因子或重组蛋白进行长期保存. 方法是:将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白如 0.1%BSA(牛血清白蛋白)10% FBS(胎牛血清)5% HSA(人血清白蛋白) 的溶液将重悬液进1步稀释然后分装冻存于-20-80即常规冰箱的冷冻1虺低温冰箱中. 

    经常有人会于细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后直接分装冻存于-20至-80这样可.穑 

    答:不行.买球网知道塑料管壁对多数蛋白均有很好的吸附作用也就是说溶液中的蛋白很容易粘附于管壁.粘附后 蛋白是很难与管壁分离的.做过 ELISA 实验的人都知道ELISA 的包被抗体(Capture antibody)就是通过这种粘附作用包被到酶 标板上的. 

    载体蛋白如 1% BSA10% FBS(胎牛血清)5% HSA 等的主要作用是预先封闭塑料管壁上的蛋白结合位点使细胞因子 或重组蛋白不会粘附于管壁.如果于细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后不用含载体蛋白的溶液进1步稀释而直接 分装冻存则溶液中的大部分细胞因子或重组蛋白均会粘附到管壁上导致溶液中实际溶解的细胞因子或重组蛋白的浓度大为降 低最终表现为细胞因子或重组蛋白活性的下降. 

    因此于分装冻存前1定要用含载体蛋白的溶液将重悬液进1步稀释.稀释后的细胞因子或重组蛋白可为任意浓度因大 量的载体蛋白可以保证低浓度细胞因子或重组蛋白仍然维持较高的稳定性. 

    那么含载体蛋白的溶液指的是什么溶液呢?水可.穑 

    答:水不可.该溶液通常是指 pH 近中性有1定缓冲能力的缓冲液如 PBS培养液(RPMI1640, DMEM )等. 

    还有1个经常被问及的问题即于做无血清培养或动物的体内实验时细胞因子中不能含有 BSAFBS 或 HSA 等动物或 人的蛋白要想长期保存细胞因子或重组蛋白该怎么办呢? 

    答:1种方法是订购 ProSpec 的"装细胞因子或重组蛋白每次使用1只用后即废弃.


    5. 后续稀释液的配方:即原产品的溶液的配方. 

    总之为保证细胞因子或重组蛋白冻干份于重悬后仍能保持良好的生物活性必须按照说明书中 Reconstitution 的方法 严格操作. 

    蛋白有价实验无价愿大家珍惜每次实验机会严谨认真每次均能得到预期的实验结果!


  • 如何确定细胞因子的种属交叉活性?

    1) 除少数例外大多数人类细胞因子对小鼠细胞均有活性.

    2) 许多小鼠细胞因子也可作用于人类细胞但比活性可能低 于对应的人类细胞因子. 

    3) IL-7 等为数不多的人类细胞因子作用于小鼠细胞时比对应的小鼠细胞因子活性更强.

    4) 干扰素 GM-CSF, IL-3 IL-4 等细胞因子种属特异对非同源细胞几乎没有活性.

    5) 相反成纤维细胞生长因子(FGFs)和神经营养素 (neurotrophins)高度保守于不同动物种属细胞上均具有很好的活性.

  • ED50 和 units/mg 之间有何关联?

    ED50 为半数有效浓度其定义是可诱导 50%好的反应的细胞因子浓度这种活性表示法仅适用于剂量反应曲线呈 S 的细胞因子.其实可以将 ED50 的值接理解为 1unit.如某种细胞因子或蛋白的 ED50 1ng/ml那么 1ng/ml 即可看作是 1unit. 那么买球网也不难理解1mg(1x106ng) 该细胞因子或蛋白中应含 1x106/1= 106units. ED50(ng/ml)转化为 units/mg 的公式如下:

    image.png

  • 为什么有时于管中看不到细胞因子或蛋白的冻干粉?

    与市场上的许多蛋白产品不同ProSpec 的产品中均不含载体蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)人血清白蛋白 (HSA)和蔗糖等并且是以最低含盐量的溶液进行冻干的因此冻干后常常不能形成白色网架结构而是微量的蛋白于冻干过程 中沉积于管内形成很薄或肉眼不可见的透明蛋白层.打开管盖前买球网建议您于小离心机中快速离心 20-30 秒使附着于管盖 或管壁上的蛋白聚集于管底.买球网的质控步骤保证每管中所含的蛋白量准确无误虽然有时您无法看到蛋白粉末但管中的蛋白 含量仍是非常好的的.

  • ProSpec 细胞因子和蛋白产品的稳定性如何?

    除非于产品说明书中特别注明ProSpec 相当1部分产品为冻干粉它们于室温条件下非常稳定(至少 1 个.).尽管如 此买球网还是建议您于收到买球网的产品后保存于-20℃以确保蛋白 100%的活性.对于大多数蛋白重悬后于 4℃仅能短期保存 (1 ).如想长期保存请先配制成稀释液(其中必须含有载体蛋白如 0.1% BSA5%HSA10% FBS)然后分装冻存于 -20℃-80℃.1定要避免反复冻融因每次冻融均会引起蛋白的部分失活.

  • Abnova抗体应用类型:

    WB           Western Blot

    WB-Ce   Western Blot (Cell lysate)         细胞裂解液(天然细胞内源)

    WB-Re   Western Blot (Recombinant protein)   重组蛋白(外源转染质粒到细菌表达蛋白)

    WB-Ti   Western Blot (Tissue lysate)      组织裂解液(天然组织内源)

    WB-Tr   Western Blot (Transfected lysate)      转染裂解液(外源转染质粒到细胞表达蛋白)

    image.png

    实验类型选择优先(涵盖范围):


    WB > WB-Ti > WB-Ce  


    WB-Re 和 WB-Tr不推荐.如果客户购买建议跟客户讲1下非官网承诺应用类型厂家不受理投诉.


  • Abnova抗体可以做多少张玻片(IF/IHC)?

    [以1:500稀释比30ul的"装抗体为例]


    1:500稀释 = 500ul 抗体稀释液中加入1ul原始抗体 ==`30ul原始抗体可以配置成为30ul * 500 = 15ml的稀释后的抗体[工作液]1张玻片1般用50ul的抗体工作液 = 15 ml / 50ul = 300张

    如果是1:200稀释的话= 120张


    作业:WB实验1条膜通常需要1ml的工作液(1:1000稀释的话需要加入1ul原始抗体溶液)实验次数自算?


    PS: 1 ml = 1000 ul


  • ICCIFIHC区别

    image.png

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  • 试剂盒-标准曲线不1样?

    · ELISA比色法实验显色是1个酶催化的实验.于1定范围内环境温度越高酶活性越强相同孵育时间内温度高的检测数据高.相同温度孵育时间长的检测数据高.

    · 说明书的标曲只是1个参考用途展示大概的结果形式.不能直接使用否则试剂盒就没有必要提供标准品了客户直接用说明书的曲线来计算了对吧.[每次实验当时都需要做标准曲线才是最准确的方法]

    · 标准曲线是否良好? 客户可以绘制相应的拟合曲线(线性或者曲线形式)R2大于0.9以上是可以接受的0.99那就是非:眯∈点后面9越多越好.


  • 试剂盒做多少个样品? [举例:KET6013]

    * 试剂盒规格的48或者96通常代表的是反应次数或者孔的数量.而不是样品数量.(标准品对照都会参与到反应或者加入到孔中因此样品数量肯定会少)


    试剂盒做1次实验需要客户做:6个标准品(标准品数量根据各个说明书里面说的来设置6个浓度点)+ 1个空白孔(标准含量为0) = 7.通常每个实验都要做复孔(最少2个复孔也有做3个复孔的.2个复孔意味着1个东西需要加到2个孔统计学需求算平均值等)这么1来被占用的孔就是7*2=14个孔.96-14=82个孔只有这82个孔可以给客户拿去测试他的样品.如果也算是复孔那么就是82/2=41个样品.这是最多可以测试多少样品.

    image.png

    总结:

    [2个复孔]样品数量= [ 96 - (标准品数量+对照组数量)*2] / 2

    [3个复孔]样品数量= [ 96 - (标准品数量+对照组数量)*3] / 3


    #强调#:标准品的数量阳性对照阴性对照 的设置根据说明书来有些试剂盒是没有阳性对照的.


    以上为1次性将试剂盒用完的样品数量.如果客户要做2次实验需要绘制2次标曲.对应的继续相减.



  • 特殊检测类型:生物发光法bio-luminescence

    1. 主要涉及ATP类的试剂盒消耗能量ATP发光(萤火虫).

    2. 主要的实验:荧光素酶分析实验.

    image.png

    使用仪器:

    1. 化学发光仪

    2. 光度计(Luminometer)

    3. 多功能酶标仪(含化学发光生物发光检测模块).


  • ELISA实验数据不稳定背景高:洗涤很关键

    1.试剂盒使用前通常需要于室温下平衡30-60min.(温度对酶催化反应有影响).

    2.洗板时需保证微孔板平放将洗涤液注满各孔但尽量避免漏液溢液以每孔300 l为宜;板洗次数1般为3次要保证洗板的浸泡时间每次浸泡时间1般为30-60 秒;尽量减少洗液残留量推荐每次洗板后进行拍板并及时更换吸水纸避免吸水纸的碎屑粘到反应孔内.


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此外,建立属地巡查管控制度。当房价出现较快上涨势头时,可根据房地产市场调控目标,根据区域房价水平、供需情况等,设置差别化价格调整幅度,切实保持房价平稳可控。因为这个地方,叫费尔干纳。
买球网英文解释:She had spoken before in front of local and national legislative bodies as well as national and international human rights committees, and to reporters, about presumably the largest-scale crime specifically targeting women in human history"The success of the show reflected the increasing global interest in China's people and culture, as well as the interest of the people of China in preserving and studying their own history," said Loewentheil, who's Historical Photography of China Collection is the largest holding of late Qing dynasty photographs of China in private hands"Russia is deeply worried over more provocative launches, which lead to further escalation of tensions on the peninsula," Kremlin spokesman Dmitry Peskov was quoted by Tass news agency as saying
买球网这会是一个不同的时代,虽然国际空间站名字中带有国际二字,但将中国排除在外就已经说明了它没有那么国际化,而中国的空间站却并不那么排外,而是面向全世界寻求合作。三是建成国家太空实验室,获取具有重大科学价值的研究成果和重大战略意义的应用成果

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